熒光素是一種常見的生物發(fā)光報告子，用于體外成螢光素酶。這種螢火蟲螢光素酶的水溶性底物（通常來自Photinuspyralis）

利用ATP和Mg2+作為共因子在氧氣的存在。通過ATP的利用，反應(yīng)可以進(jìn)一步用于指示能量或生命的存在是為了起到生死攸關(guān)

的污點(diǎn)的作用。

螢火蟲螢光素酶是研究基因最chang用的報告基因之一表達(dá)由于其ji端的敏感性，以及快速，易于使用的系統(tǒng)。螢光素酶用于監(jiān)測

細(xì)菌、培養(yǎng)細(xì)胞以及轉(zhuǎn)基因植物或動物。它是一種約61kDa的蛋白質(zhì)，作為單體具有活性，不需要加工其活動。螢火蟲螢光素

酶通過催化熒光素的氧化羧化作用產(chǎn)生具有任何已知生物發(fā)光中最gao效率之一的反應(yīng)。螢光素活性可以通過與啟動子/增強(qiáng)子的

相關(guān)性來表征基因調(diào)控元素。優(yōu)化后化學(xué)發(fā)光反應(yīng)和調(diào)節(jié)元件的轉(zhuǎn)錄活性。

本手冊旨在介紹一種簡單、經(jīng)濟(jì)、可靠的方法，用于在體外報告系統(tǒng)中檢測熒光素酶活性。

生物發(fā)光反應(yīng)：

幾個因素可能會影響反應(yīng)的靈敏度，包括溫度、pH或底物濃度我們建議使用pH為7.8的緩沖液，并在使用前將所有試劑預(yù)熱至

室溫，以獲得最佳結(jié)果。GoldBio還建議添加在測定緩沖液中過量的ATP和Mg2+用于更好的反應(yīng)。

當(dāng)熒光素被添加到螢光素酶樣品中時，會立即產(chǎn)生閃光在0.3-0.5秒內(nèi)達(dá)到峰值強(qiáng)度。然后，光線開始迅速衰減一半壽命約為0.5

-1.0分鐘。但當(dāng)輔酶A最初加入測定緩沖液時能夠防止快速反應(yīng)衰變延長了反應(yīng)2-5分鐘。如果稍后添加到反應(yīng)中混合物，輔酶A也促進(jìn)額外的二次閃光。

Gold Bio推薦基于Yuichi Oba等人（2003）：

-100mM Tris-HCl（pH 7.8）

-5mM MgCl2

-250μM CoA

-150μM ATP（Fraga，2008）

-150μg/mL d-熒光素（GoldBio）

一些研究人員還添加了二硫蘇糖醇（DTT）或EDTA等成分（Steghans，1998）。您可以調(diào)整您的特定分析緩沖液以達(dá)到最佳

效果滿足您的需求。我們建議對您的特定細(xì)胞進(jìn)行動力學(xué)曲線的初步測試以獲得最佳效果。

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